BROMOANISOLES....la culpa no siempre es de los corchos

BROMOANISOLES....la culpa no siempre es de los corchos (15/03/2005)

Autora: Msc. Nora Barda- CIATI AC

El olor a moho o humedad (muchas veces descripto como olor a corcho) es uno de los defectos más frecuente y desagradable en vinos. Varias moléculas han sido identificadas como responsables de este olor. Entre ellas se puede mencionar al 2,4,6 Tricloroanisol (TCA), encontrado en la mayoría de los vinos catalogados con olor a corcho. Sin embargo el término olor a corcho es frecuentemente inapropiado ya que a pesar de que los corchos obtenidos a partir de la corteza del alcornoque, pueden liberar TCA si la calidad del proceso de manufactura no es satisfactorio, existen otras fuentes de contaminación. Por ejemplo el Pentacloroanisol (PCA) y el 2,3,4,6 Tetracloroanisol (TeCa), también responsables de estos olores, son producidos por degradación de ciertos pesticidas que contienen 2,3,4,6 Tetraclorofenol (TeCP) o Pentaclorofenol(PCP) con TeCP como impureza. Estos compuestos pueden contaminar vinos que NO han estado en contacto con los corchos.
Algunos vinos presentan el mismo tipo de defecto sensorial pero no contienen cantidades suficientes de Cloroanisoles a los que pueda responsabilizarse por estos olores. En estos casos se ha reportado la presencia de otro contaminante halogenado: el 2,4,6 Tribromoanisol (TBA) (Chatonnet et al., 2004). Vinos contaminados con altas concentraciones de TBA (más de 20 ng/l), parecen tener además de un intenso olor a moho, olor a fenólico o a yodo . Este defecto es percibido en la parte posterior del paladar cuando el vino es degustado y persiste en el ‘after taste’.

ORIGEN

Se cree que el precursor del TBA es el 2,4,6 Tribromofenol (TBP) y que las bacterias (u hongos filamentosos) son los responsables de la conversión de TBP a TBA realizando la O-Metilación del fenol original.
El TBP aparece en la naturaleza naturalmente o por contaminación ambiental.
El TBP puede ser naturalmente formado en aguas de desecho tratadas con cloro en presencia de iones bromuro y trazas de compuestos fenólicos . El cloro puede oxidar los iones bromuro liberando bromo que luego se combina rápidamente con un gran número de contaminantes orgánicos presentes en al agua, produciendo de esta forma Clorofenoles y Bromofenoles. En los océanos, el TBP ha sido identificado en algas marinas (que tienen la capacidad de sintentizarlo), esponjas, organismos bentónicos y animales marinos superiores como crustáceos. Boyle et al., 1992, afirman que la aparición de TBP en salmones, está relacionado con la ingesta de animales pequeños que pueden biosintetizarlo o acumularlo a partir de otros animales o plantas y que en concentraciones pequeñas pueden impartir notas deseables a olor a mar o a yodo.
Por otro lado, industrialmente, derivados de TBP sintéticos son ampliamente utilizados como retardadores de llama en laminados sintéticos, resinas y en polímeros orgánicos destinados para uso en equipos electrónicos. También han sido utilizados como conservantes de madera y fungicidas generales para uso en cueros, textiles, pinturas, plásticos, papeles y pulpas.
Es claro que el TBP así como otros Bifenilos Polibrominados (PBB) que también se utilizan como retardadores de llama, están siendo volcados al medioambiente global y se pueden acumular en los tejidos de los humanos y vida salvaje. Especial atención se está prestando al material de madera, fibras o cartones, así como plásticos reciclados que fueron inicialmente tratados con estos compuestos o que lo contienen como parte del polímero.
Según Chatonnet et al. (2004), a diferencia del Pentaclorofenol (PCP) cuyo uso está restringido y prohibido en Europa pareciera que no existieran todavía, restricciones en el uso del TBP.

MECANISMO DE PRODUCCION

A pesar de la implicancia económica para la industria del vino (el costo de vinos contaminados por estos compuestos en el mundo excede los 10 billones de dólares/año), todavía no se conoce muy bien el mecanismo de formación del TBA aunque sí se sabe que es similar al de producción del TCA.
Los Anisoles, NO TÓXICOS, derivan de la O metilación de los Halofenoles, que son ALTAMENTE TOXICOS como parte de una reacción normal de detoxificación del medio mediada por diferentes especies de microorganismos.
Los hongos filamentosos siempre han sido considerados como los responsables de la aparición de los Anisoles aunque parece no existir una correlación entre el crecimiento de alguna cepa en particular y la aparición de los mismos.
Algunos hongos aislados de los corchos involucrados en la producción de TCA pertenecen a los géneros: Penicillium, Trichoderma, Acremonium, Chrysonilia, Cladosporium, Fusarium, Mortierella, Mucor, Paecilomyces y Verticillium siendo las velocidades mayores de conversión para cepas de Trichoderma y Fusarium.
La metilación se lleva a cabo por enzimas excretadas por estos hongos. Los microorganismos que degradan la lignina son los ideales para degradar los Halofenoles ya que las mismas enzimas implicadas en la degradación de las ligninas (incluyendo las peroxidasas, dioxigenasas y reductasas de quinonas) son efectivas para eliminar el Triclorofenol (TCP).
En algunas especies de hongos, esta enzima es inducida por la sola presencia del TCP (necesita exposición al TCP para generarse), mientras que en otras presentan una actividad de metilación residual probablemente desarrollada por otras razones.
Coque et al.,2003, quienes fueron capaces de aislar la enzima O metiltransferasa a partir del Trichoderma longibrachiatum, reportan que la enzima alcanza su máxima actividad de conversión a las 8 hs de incubación a 28 ºC, pH óptimo 8.2-8.5. Esta enzima no resultó inhibida por ninguno de los inhibidores comúnmente utilizados como Glicerol, Cisteína, Glucosa o Amoníaco, sin embargo fue muy sensitiva a la acción de ciertos metales como Cu+2, Ag+, Hg 2+ y Zn2+ . Los autores demostraron también que esta enzima es responsable de convertir TBP a TBA.
Debido a los mecanismos de producción de Anisoles tan diversos y la heterogeneidad de la carga microbiana encontrada tanto en los corchos como en el medio ambiente, concluyen que en realidad el problema debería enfocarse en la eliminación de los Clorofenoles y Bromofenoles del medio ambiente, sea a través de biotecnología o medios mecánicos, más que a la reducción de la carga microbiana.

OCURRENCIA

Existen varias publicaciones donde se mencionan episodios de contaminación de alimentos con TBA. En Australia por ejemplo, se encontró que algunos materiales de fibras corrugadas utilizados para la construcción de envases de alimentos, estaban contaminados con altas concentraciones de TBP (Whitfield et al., 1997) y se sospechaba que podía ser la causa de la aparición de un defecto sensorial intenso en alimentos, ya que los hongos presentes en dicho material podían convertir el TBP en TBA. Entre algunas de las 17 especies de hongos aisladas e identificadas en estas fibras corrugadas y pisos de maderas de contenedores, se puede mencionar al Paecilomyces variotii, un conocido metilador de TCP.
Los autores de este trabajo, reportan que este microorganismo fue capaz de convertir todo el TBP con que el material había sido contaminado en TBA después de 6 semanas de incubación a 30 ºC.
También realizaron un estudio de permeación de este compuesto a través del film de polietileno que envolvía a uvas sultanas. Así demostraron que el TBA puede permear fácilmente del cartón contaminado, a través del film de polietileno, a la uva. La temperatura de almacenaje no pareció ser un factor demasiado importante pero sí lo fue el tiempo de almacenaje ya que doblando el tiempo (de 7 a 14 días) resultó en un incremento del 60% en la cantidad de TBA absorbido. La presencia de aceite en la superficie de las uvas, favoreció la absorción de TBA en las uvas ya que es de naturaleza lipofilica. La velocidad de difusión y disolución en polietileno, son comparables con las observadas para el TCA.
Se ha reportado también, la presencia de estos contaminantes en peras frescas almacenadas en cajones tratados con TBP como fungicida (Wylie, H., 1997) así como la contaminación de fármacos a través de los tapones de polietileno contaminados o por haber contenido fenol como bactericida.
Otro caso se relaciona con el agua de consumo humano, producto donde la aparición de notas a moho, estuvo siempre asociada a la presencia de actinomycetes así como a cianobacterias y hongos o sus productos metabólicos como Geosmín o Metilsoborneol. Sin embargo, en un tanque de la red de agua ubicado cerca de París, se observó el deterioro sensorial de la misma, después de la aparición de algunas rajaduras en la cobertura impermeabilizadora del tanque. Dicha cobertura era una mezcla de cemento elástico con una resina sintética. El único compuesto que fue encontrado en el agua a una concentración de 5.6 ng/l fue TBA. Aparentemente, la cobertura del tanque emitió Fenol, que al clorinarse ( o brominarse) debido a la presencia de cloro (o bromo) con que se trataba al agua, formó TBP. Se estima que el TBA luego fue sintetizado por los organismos vivientes presentes en la superficie de la cobertura (Benanous et al., 2003).

FUENTES DE CONTAMINACION EN VINOS

Como en el caso del PCP y TeCP, el TBP y el TBA pueden contaminar los vinos directamente o a distancia a través de la atmósfera. Chatonnet et al. (2004), utilizando una mezcla de materiales adsorbentes como Bentonita para atrapar contaminantes en el medio ambiente, demostraron que TBP y TBA son los principales contaminantes encontrados tanto en la atmósfera de las bodegas como en los barriles viejos, encuadrados de madera de los sótanos, paredes de concreto, pinturas y ladrillos. Aún en aquellas bodegas donde los barriles más viejos y contaminados habían sido eliminados, fue posible detectar trazas de estos contaminantes probablemente adsorbidos en las superficies porosas de las paredes o pisos o estructuras de maderas.
Por otro lado, al monitorear diferentes elementos de las bodegas como corchos, tapones, juntas de gomas, trozos de madera, etc las concentraciones más altas de estos compuestos se encontraron en los tapones de silicona, partes superficiales de las estructuras de madera (3mm) y estanterías de madera. Clorofenoles como TCP, TeCP, PCP fueron encontrados fundamentalmente en tapones tanto sintéticos como de corchos, mientras que TCA fue encontrado específicamente en los corchos. Aún en los corchos es difícil dilucidar si fue producido in situ o proviene de lugares contaminados. En el caso de los tapones de plástico o los de silicona es evidente que la contaminación ha sido atmosférica o a traves de superficies contaminadas con TBP.
Los autores concluyen que la calidad del aire en las zonas de almacenado es de vital importancia para asegurar la inercia química y sensorial de los materiales que van a estar en contacto con el vino.

PROPIEDADES FISICO QUIMICAS

La cantidad y tipo de contaminante encontrado en la atmósfera o en el seno de un líquido o adherido a alguna superficie depende de las propiedades físico-químicas de estos compuestos.
En general son compuestos hidrofóbicos, de alto punto de ebullición ( 241 a 309 ºC). Los Halofenoles en general poseen menor presión de vapor y mayor constante de Henry lo cual significa que son menos volátiles que los Haloanisoles.
El hecho de que sean hidrofóbicos implica que pueden disolverse o adsorberse fácilmente en superficies plásticas o siliconadas como polietileno, poliester, goma vulcanizada, y tapones de silicona usados en los barriles. Estos materiales fijan contaminantes del aire y luego los liberan en los vinos con el tiempo.
En general a medida que el número de halógenos incrementa en la molécula hay una reducción en la presión de vapor, incremento en el punto de ebullición, y reducción en la solubilidad del agua. Por lo tanto aquellos fenoles más clorinados o brominados son más susceptibles de quedarse en sedimentos, lípidos y por lo tanto bioconcentrarse. Aquellos menos halogenados, presentan presión de vapor más alta, por lo tanto pueden evaporarse a partir del agua y son más factibles de encontrar en el aire. En general los Halofenoles son un grupo pobremente biodegradable y persistente en el medioambiente.

TOXICOLOGIA

A diferencia de otros retardantes de llama como Pentabromofenol, Tetrabromobifenol ,TBA y TBP no poseen severos efectos toxicológicos en las concentraciones medidas en los vinos.

UMBRALES

El umbral de TBA reportado en agua fue de 0.020 ng/l y en uvas sultanas de 2 ng/l (Whitfield, et al., 1997). Otros valores publicados, hablan de 0.008 ng/l o 0.03 ng/l siendo similares a los reportados para TCA en agua.
Chatonnet et al. ,2004, informan que en una solución modelo de ácido Tartárico (ph 3.5-4.0) y 10% alcohol, el umbral de TBA fue de 3.4 ng/l, mientras que en vino fue de 7.9 ng/lt, aunque el TBA puede afectar la calidad de los vinos a niveles menores que su umbral de identificación.
Con un umbral similar o un poco más pequeño que el del TCA, el TBA puede ser considerado una amenaza potente si se convirtiera en un contaminante ubicuo.
Es importante recordar que la concentración de Haloanisoles aún por debajo del umbral en vino, puede contribuir a incrementar los defectos sensoriales cuando se combinan con Haloanisoles provenientes de otras fuentes como corchos.

DETERMINACIÓN ANALÍTICA

La determinación analítica de TBA se realiza utilizando una fibra de microextracción en fase sólida cuya función es la de concentrar los componentes volátiles del espacio de cabeza del vino o de la solución de embebido de corchos, chips, o maderas. Los compuestos son luego analizados por cromatografía gaseosa con detección por espectrometría de masas (GC-MS).
El límite de detección es de 1 ng/l, y el de cuantificación (LC) es de 2 ng/l.

CONCLUSION:

Teniendo en cuenta que la aparición de TBA se trata fundamentalmente de un problema de contaminación ambiental (de la cual poco se conoce o se hace en nuestro país), mediada por ciertos microorganismos (de los que no se sabe a ciencia cierta cuáles son los responsables ni cómo lo producen), es fundamental para las bodegas, en primera instancia, conocer cuál es el nivel basal de este contaminante en el vino que producen para determinar la dimensión del problema.
Deberán asegurarse que los biocidas utilizados (en campo o bodegas) así como pinturas, resinas etc. , NO contengan Halofenoles en su fórmula, extremar las condiciones de higiene ambientales, y NO utilizar sanitizantes que contengan Cloro o Bromo para evitar problemas posteriores cuyas causas no son siempre fáciles de identificar.
Si el problema existiera, es recomendable realizar el control de maderas, barricas, corchos e insumos, y por supuesto realizar el monitoreo ambiental de estos contaminantes para determinar cuál es la fuente de contaminación.
Para concluir debemos destacar entonces que la prevención y la realización de seguimientos periódicos en el vino antes de embotellar, son las mejore herramientas precautorias para la detección temprana de una posible contaminación.

BIBLIOGRAFIA

1. Chatonnet, P., Bonnet, S., Boutou, S. and Labadie – Identification and Responsability of 2,4,6 Tribromoanisole in Musty, Corked Odors in Wine – J. Agric. Food Chem. 52: 1255-1262, 2004
2. Boyle, J. L., Lindsay, R. C., and Stuiber, D. – Bromophenol Distribution in Salmon Selected Seafoods of Fresh- and Saltwater Origin – J. of Food Science –57: 918-922, 1992.
3. Whitfield, F. B., Hill, H. L. and Shau, K.J. – 2,4,6 Tribromoanisole: a Potential Cause of Mustiness in Packaged- Food. J. Agric. Food Chem., 45: 889-893, 1997.
4. Wylie, P., - Trace Level Pesticide Analysis by GC/Ms Using Large-Volume Injection- Agilent application note – Sept. 1997.
5. Benanous, D., De Roubin, M., Wylie, P. – Stir Bar Sorptive Extraction: a New Way to Extract Off-Flavor Compounds in the Aquatic Enviroment.- Agilent application note- March 2003.
6. Coque, J. , Alvarez-rodrigues, M., and Larriba, G. – Characterization of an Inducible Chlorophenol O-Mehtyltransferase from Trichoderma longibrachiatum Involved in the Formation of Chloroanisoles and Determination of Its Role in Cork Taint of Wines – Applied and Enviromental Microbiology, 69(9): .

Origen información: CIATI